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    2. 細胞培養方法

      2007-10-03 | 軟瓊脂集落形成率實驗(軟瓊脂克隆)
      將1.2%低熔點瓊脂糖與2×細胞培養基以1:1 的體積比混合制備0.6%的底層瓊脂,6 孔板中每個孔1.4ml 溫室凝固,取對數期細胞,胰酶消化后吹散成單個細胞懸液,計數,并調細胞濃度為10000 個/ml,將0.6%低熔點瓊脂糖與2×細胞培養基以1:1 的體積比混合,制備0.3%的上層瓊脂,每孔加1ml 上層瓊脂和100ul 單細胞懸液(約1000cell/well),混勻,室溫凝固。置于37℃,5%CO2 的細胞培養箱中培養2-3 周,計數含50 個細胞以上得克隆,計算細胞集落形成率,SpotII 采集圖像。
      2007-10-03 | MTT檢測細胞增殖及見解
      細胞以每孔3000個接種**96孔板,分成不同組,每組3孔,利用含有10% 胎牛血清的DMEM培養液培養24 h之后,向培養液中加入一定工作濃度的藥物(單體或混合物),繼續培養24 h或48h。培養結束,直接向每孔加入5mg/ml的MTT 10μl,孵育2-4小時(應常在顯微鏡下觀察)。去除培養液,每孔加入DMSO 100μl,充分振蕩3分鐘,立即在酶標儀上測定490nm的吸光度值。
      由于這種方法基于琥珀酸脫氫酶的活性,因而加入MTT之后應該在顯微鏡下觀察,藥物是否可以改變細胞琥珀酸脫氫酶的活性。若是改變則不可以使用此種方法。
      另有根據細胞ATP含量測定細胞增殖的方法,但是都要考慮藥物對細胞ATP是否有影響。
      所以測定細胞增殖,**簡單,**原始,**麻煩的方法,進行細胞計數我們感覺還是**好的方法。
      細胞培養方法
      哺乳動物細胞培養規則:
      1,  嚴格按照細胞培養室規則進行哺乳動物細胞,由于細胞為整合生物中心共用,使用緊張,在使用時盡可能提高速度,保證操作規范。
      2,  使用細胞間之后,主動將安全柜臺面和桌面等清理整齊干凈。
      3,  在自己培養細胞出現污染之時,及時通報同一培養箱培養細胞者,并將培養相關細胞的培養液/PBS/胰酶等全部清出細胞培養室,以減輕對細胞培養的影響。
      4,  實驗所用細胞培養原則要求:A,細胞復蘇之后兩代開始使用;B,保證細胞每次傳代前密度不超過90%;C,細胞使用**多12代(約2個月)。
      5,  **好每天觀察細胞生長狀態,若有異常及時處理。
       
      細胞傳代方法
      1,  將長**80-90%細胞的培養瓶中原來的培養液棄去。
      2,  加入0.5—1ml 0.25%胰酶溶液,使瓶底細胞都浸入溶液中。
      3,  瓶口用瓶蓋蓋好,放在倒置鏡下觀察細胞。隨著時間的推移,原貼壁的細胞逐漸趨于圓   形,在還未漂起時將胰酶棄去,加入適當體積的培養液終止消化。觀察消化也可以用肉眼,當見到瓶底發白并出現細針孔空隙時終止消化。一般室溫消化時間約為1—3分鐘。根據不同細胞而異。
      4,  用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液,盡可能的避免氣泡產生,分到另外兩到三瓶中,置37℃下繼續培養。第二天觀察貼壁生長情況。
      96/24孔板傳代:
      1,  前同于普通細胞傳代方法。
      2,  細胞吹打均勻后,對細胞進行計數,根據需要調**適當濃度。例如:每孔傳代10000個細胞,可以將細胞調**濃度十萬,之后利用排槍,吸取100ul,**96孔板中。
      3,  24孔板,采用1ml移液器進行傳代。
       
      細胞凍存方法
       
      1,  預先配制凍存液:含90%FBS,10%DMSO的凍存液,DMSO液用培養液配好,避免因臨時配制產熱而傷害細胞;
      2,  取對數生長期細胞,經胰酶消化后,加入適量凍存液,用吸管吹打制成細胞懸液(1×106 ~ 5 ×106細胞/ml);
      3,  加入1ml細胞于凍存管中,密封后標記冷凍細胞名稱/冷凍日期/操作者。
      4,  放于程序降溫盒,之后在-80℃冰箱過夜。
      5,  將程序降溫盒中細胞放于液氮保存。
      6,  要保證凍存細胞數量。
       
      細胞復蘇方法
      1,  從液氮中取出冷凍管,迅速投入37~38 水浴中,不斷搖動使其融化(1分鐘左右);
      2,  盡快用培養液稀釋**原體積的10倍以上;
      3,  低速離心10分鐘,1000轉;
      4,  去上清,加新鮮培養液培養剛復蘇的細胞。
      5,  盡快對復蘇細胞進行換液。
      6,  擴大培養后,再凍存**少復蘇數量的細胞,以保證細胞庫的完整。
       
      細胞計數
      1、將血球計數板及蓋片用雙蒸水擦試干凈,并將蓋片蓋在計數板上。
      2、將細胞懸液吸出少許,滴加在蓋片邊緣,使懸液充滿蓋片和計數板之間。
      3、靜置3分鐘。
      4、鏡下觀察,計算計數板四大格細胞總數,壓線細胞只計左側和上方的。然后按下式計算:細胞數/ml=4大格細胞總數/4×10000
       
      實驗前準備下列物品:雙蒸水 瓶子(500ml、250ml),離心管,tip頭,Eppendorf管,濾紙,餐巾紙,微量加樣器20-50µl。  具體實驗步驟如下:
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